El día viernes 19 de Junio se realizó en Tandil el acto de lanzamiento formal de las Actividades en marcha de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA, en el marco del Programa Agrovalor I que cuenta con financiación del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca y de la Secretaría de Políticas Universitarias perteneciente al Ministerio de Educación de la Nación. A dicho acto asistieron autoridades de ambos ministerios y autoridades provinciales, municipales, universitarias, productores y representantes del sector agropecuario.
El Programa AGROVALOR convocó oportunamente a las universidades Nacionales para la creación de Unidades Productivas de Innovación Agropecuaria y Agregado de Valor (UPIAAV). Se trata de complejos productivos innovadores con alta potencialidad de trasferencia de conocimientos, innovación y vinculación tecnológica al sector productivo, en particular a pequeños y medianos productores. Se presentaron más de 80 proyectos a nivel nacional entre los cuales resultaron financiados dos correspondientes a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA.
Uno de estos proyectos consiste en la creación de una Unidad de Capacitación y Asesoramiento Técnico a productores del sector porcino, la mayoría de ellos pequeños productores que conforman la Asociación de Productores Porcinos de Tandil (APPORTAN). La puesta en marcha de esta Unidad será una herramienta de potenciación para la cadena de valor de la carne porcina en la región contribuyendo a la generación de mano de obra calificada y al agregado de valor en origen a la producción primaria. El proyecto incluye una intensa tarea de capacitación a productores y la concreción de una Unidad de Extracción, Manejo y Distribución de Semen Porcino.
El otro proyecto se relaciona con el Cluster Quesero de Tandil, del cual la Facultad de Ciencias Veterinarias participa en forma activa, siendo un aspecto de gran importancia la implementación de un Laboratorio de Referencia en Calidad de Leche. En respuesta a esta demanda, la Facultad con financiamiento proveniente de AGROVALOR, obtuvo los fondos necesarios para la compra de un equipo contador de bacterias en leche, que permitirá complementar el equipamiento ya existente en los laboratorios de la Unidad Académica y el adquirido mediante la elaboración del plan de mejora competitiva con la participación del PROSAP. La adquisición de este equipo pondrá a este laboratorio en condiciones de ser acreditado en un futuro como Laboratorio de Referencia en Calidad de Leche, largamente solicitado por los tamberos de la región.
En el marco de este acto de lanzamiento formal de actividades de AGROVALOR I, se realizó también una jornada Técnica sobre Reproducción Porcina.
El Ing. Sean Scally continuará como presidente de La Cámara Argentina de la Industria de Productos Veterinarios, que anunció su nueva Comisión Directiva para el ciclo 2015-2016, que quedó constituida, por elección de sus miembros en Asamblea Anual realizada el pasado 22 de junio.
Ingresando en hablandodelonuestro.com.ar podrán seguir en tiempo real la participación que este 2 de julio tendrá la especialista en Bienestar Animal en el el segundo encuentro para Veterinarios que organiza la Cámara Argentina de Feedlot en Pilar, Buenos Aires.
Este jueves 2 de julio se llevará adelante en Pilar, Buenos Aires, el segundo encuentro para veterinarios organizado por la Cámara Argentina de Feedlot.
Interesante es mencionar que todas las disertaciones que allí se lleven adelante podrán escucharse en tiempo real, por Internet, ingresando en la Radio en Vivo que se encuentra disponible en el sitio Web www.hablandodelonuestro.com.ar.
Temple Grandin
La disertante principal del evento será la norteamericana Temple Grandin, quien compartirá sus conocimientos en relación al Bienestar Animal desde las 9.00 horas.
Vale decir que Grandin es una de las principales referentes mundiales en Bienestar Animal y divulgadora de temas vinculados con su condición. Pese a haber sido diagnosticada con Síndrome de Asperger, un tipo de trastorno del espectro autista (TEA) a la temprana edad de tres años, logró alcanzar el título de licenciada en Psicología y luego estudiar Ciencia Animal en las universidades de Arizona e Illinois, Estados Unidos, donde obtuvo su doctorado. Actualmente es profesora de Comportamiento Animal en la Universidad de Colorado.
Más expertos
La jornada seguirá con la participación especial del Dr. Ernesto Odriozola (INTA) con una charla técnica sobre la actividad productiva intensiva a las 10.15 horas.
Ya a las 11.30 horas se llevará adelante un panel conformado por distintos médicos veterinarios sobre la “gestión sanitaria en los feedlots”.
Por la tarde (desde las 14 horas) tendrá lugar un ámbito de debate entre los asistentes, mientras que a las 15.30 se conocerán las principales conclusiones de la jornada.
Articulado por entes gubernamentales provinciales y nacionales, todo el arco ganadero provincial comenzó a trabajar hoy en la generación de alternativas que apunten a mejorar la productividad y los eslabones de toda la cadena que también contemplan la comercialización y la industrialización. Fue en el marco del 1º Foro de Ganados y Carnes de la Provincia que se desarrolló hoy jueves 18 de junio por la mañana en las instalaciones de la Sociedad Rural de Corrientes, que contó con la presencia del ministro de Producción de la Provincia, Ing. Arg. Jorge Vara; y el subsecretario de Ganadería de la Nación, Med. Vet. Jorge Dillon.
Organizado conjuntamente por el Ministerio de Producción, el INTA, la UNNE y la Secretaría de Agricultura Familiar, el encuentro contó con la presencia de representantes de la producción primaria, frigoríficos, matarifes, carniceros, intermediarios, prestadores de servicios sanitarios, financieros y bancarios y organizaciones gubernamentales. Al finalizar las exposiciones, se llevaron adelante talleres en donde quedaron plasmados las propuestas del sector para ir siendo analizadas y pasadas en limpio.
El ministro Vara fue el encargado de abrir la convocatoria abogando para que en este encuentro se “analicen soluciones en función de todos los eslabones de la cadena, una de las seis de la provincia y la más importante”, y agregó que se está concluyendo con un trabajo sobre en producción primaria que en primera instancia arroja que “el 48% proviene de esta cadena, y el otro 52% de las otras cinco”. “Lo digo con total reconocimiento, objetivamente, esto es así”, aseveró, ya que “desde el punto de vista social, es lejos la de mayor importancia en la provincia y ya que incluye a alrededor de 25 mil productores ganaderos”.
Y fundamentando el fuerte impacto social que genera la ganadería, Vara también dijo que es una de las principales actividades que generan el arraigo “y no puedo dejar de visualizar esto”, “por eso es importante tratar de mejorar esta cadena porque el mejoramiento de la vida en el interior profundo depende de ella y lo tenemos claro”. “Todo lo que hagamos es poco en relación al impacto social, político y económico que tiene en nuestra provincia y particularmente en nuestro interior profundo”, reconoció.
A colación de lo indicado, el ministro referenció que debido a esa importancia el Plan Ganadero Provincial 2010-2020 “es el más importante que tenemos en el Ministerio porque tenemos que fortalecerlo”, pero que para hacerlo “necesitamos la ayuda y acompañamiento de todas las instituciones, y estamos todos, no falta nadie”. “Esperemos que esto perdure y que lleguemos a conclusiones interesantes, y trataremos de visualizar los resultados, porque podemos hacer más ya que hasta aquí hemos avanzado en función de las demandas”, reflexionó, y reconoció que desde Nación es “uno de los pocos programas en los que nos han acompañado”.
Participaron en la mesa de presentación, además de Vara y Dillon, el subsecretario de Agricultura y Ganadería, Lic. Manuel García Olano; el director del Centro Regional Corrientes del INTA, Ing. José Luis Russo; el presidente del Consejo Regional del INTA, Dr. Pablo Maldonado Vargas; el coordinador de la Delegación Corrientes de la Secretaría de Agricultura Familiar de la Nación, Lic. Benjamín Leiva, el decano de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE, Med. Vet. Elvio Ríos; y el presidente de la Sociedad Rural de Corrientes, Ing. Martín Moncada.
García Olano: “Desarrollar comida para ganar productividad”
El secretario de Agricultura y Ganadería de la Provincia fue el encargado de exponer la realidad ganadera de Corrientes y quien, tras un análisis global de la coyuntura, dijo que la ecuación se reduce en “generar comida para ganar productividad”. Obviamente que, para llegar a ese resultado, se debe cambiar el perfil productivo actual, ya que a su entender se puede darle mucho más valor agregado a la cadena si se cambia el paradigma.
García Olano realizó un paneo sobre la producción ganadera indicando que a 2014 la provincia cuenta con unas 96.000 cabezas, de las cuales un número muy inferior se faenan en Corrientes que cuenta con 29 plantas frigoríficas habilitadas. Sin embargo, ello se contrasta con que a raíz de la poca demanda por un lado y la faena ilegal por otro, 14 de las plantas se encuentran cerradas; a saber: Lavalle, santa Lucía, Pellegrini, Mocoretá, 9 de Julio, Guaviraví, San Carlos, Esquina, Gobernador Martínez, Lomas de Vallejos, Palmar Grande, Mariano I. Loza, Mantilla, Chavarría y Perugorría.
El funcionario hizo mucho hincapié en la importancia de cambiar para mejorar la productividad, pero que el principal problema que se plantea es que hay que producir más forraje “porque el pasto natural que tenemos no alcanza: hay que generar recursos forrajeros”. Corrientes casi no produce engorde, ya que la mayor parte va a otras provincias y eso le resta valor agregado a la producción.
Para García Olano, el poco gordo y vacas menos productivas obedece al tema nutricional. A través del Plan Ganadero la situación se fue revirtiendo para varios productores y se busca que la generación de pasturas y verdeos de inviernos vaya multiplicándose para generar más alimento, en virtud que a diferencia del resto del país, en Corrientes se produce poco maíz, soja, trigo y sorgo. “Hay que desarrollar comida para generar productividad”, reflexionó entre otros conceptos.
Compartimos el informe de Senasa, con la palabra de Esteban Durante, que reconoció, mediante su Resolución 120/2015, el Pasaporte Equino emitido por el Stud Book Argentino del Jockey Club Argentino como documento sanitario válido cuando el mismo esté habilitado ante el Organismo.
Se trata del desarrollo de una nueva línea de productos: Lechera Aguda y Lechera Secado, jeringas de antibiótico intramamario para el tratamiento de la mastitis en bovinos.
En su búsqueda constante de innovación y desarrollo, Ceva se compromete una vez más con el negocio del productor lechero y pone al alcance de los profesionales de la salud animal una nueva línea de productos con la cual obtener más “Tambos Seguros”.
“Hoy con Lechera, damos nuestro primer gran paso diversificando nuestro portfolio de productos para ingresar al segmento de la lechería. Ceva a nivel mundial está trabajando activamente en el desarrollo de productos innovadores y diferenciales para este importante segmento”, comentó Patricio Roán, Country Manager de Ceva Salud Animal.
Por su parte, José Dupraz, Gerente de la Unidad de Negocios Rumiantes agregó que “Hasta hoy la Tuberculina PPD Bovina era nuestro principal producto con presencia en el tambo. Con Lechera, Ceva tiene el primer producto no biológico desarrollado en Argentina específicamente para la problemática sanitaria del tambo, con una presentación innovadora y atractiva para el productor lechero. Ceva, amplía una vez más la oferta de soluciones disponibles para nuestros clientes”.
El Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación informó que la cuenca lechera argentina produce cerca de 11.600 millones de litros de leche anuales y se estima que la mastitis llega a provocar pérdidas en los rindes de hasta el 10%.
La mastitis constituye, una de las principales problemáticas sanitarias del tambo, de gran importancia económica y cuyas principales pérdidas se dan por las mermas productivas y el descarte de leche.
El próximo 13 de julio comienza el Curso de Posgrado en Oncología organizado por www.veterinariosenweb.com y dirigido por la Dra. Laura Peruzzo, con quien dialogamos para conocer más acerca del contenido.
«Lo interesante del curso es que es enteramente on line y da la posibilidad de no tener lucro cesante y estar en contacto con excelentes profesionales» afirmó Peruzzo, quien estará dirigiendo el curso de Posgrado que dura 5 meses con 150 horas académicas reales.
Además Peruzzo destacó el crecimiento de la oncología en los últimos años y también reveló el objetivo del Posgrado: «Llevar la oncología al médico clínico».
El jueves 25 de junio se realizarán las XXIII Jornadas Ganaderas de Pergamino en la Sociedad Rural de esa ciudad y para conocer más entrevistamos al Dr. Carlos Kitroser, organizador principal del evento.
«Como siempre está principalmente apuntada a productores agropecuarios y también y los asesores de campo, porque se habla de tecnologías y novedades, así que es interesante que participan juntos» contó Kitroser.
«Por la mañana está apuntada a la parte tecnológica: Producción de pasto y oferta forrajera, Nutrición Prenatal, Mitos y creencias erróneas en tamaño y tipo de vacas y también perspectivas del negocio de carnes» enumeró.
«Por la tarde vamos a tratar Sustentabilidad de los sistemas de producción desde el punto de vista económico, ambiental y físico» dijo el organizador.
Se trata de Hidramax, una solución concentrada de electrolitos indicada para mantener el balance ácido-base, el equilibrio metabólico mineral y aportar energía. Además contiene Glutamina, un aminoácido que ayuda a mantener la óptima integridad del intestino e interviene en la reparación de las células dañadas durante la diarrea. Hidramax es líquido y se diluye fácilmente con la leche, sustituto lácteo o agua.
Durante el 1er Congreso Veterinario Latinoamericano del Interior Drovet entrevistamos a Mercedes Savickas, de Merial, quien pasó por el Estudio Móvil de HN.
El médico veterinario y encargado de definir los contenidos durante el 1er Congreso Veterinario Latinoamericano del Interior organizado pór Drovet, Carlos Sorribas, explica sus contenidos.
Compartimos la entrevista realizada con Gervasio Videla Dorna, de Zoetis en el 1er Congreso Veterinario Latinoamericano del Interior organizado por Drovet.
Laboratorio Azul Diagnóstico cumple 40 años de vida y para conocer parte de su historia y trayectoria dialogamos con los Dres. Alfredo Martínez y Ramón Noseda, presidente y vice presidente de la firma.
“Creo que nosotros llenamos un espacio motivado por los propios veterinarios. Ellos mismos nos fueron empujando y nosotros empezamos con diagnósticos que antes hacían los veterinarios. Llegar a hacer lo que necesitaban, porque los diagnósticos les ocupaban mucho tiempo y no siempre eran prolijos, así que nosotros fuimos un soporte para ellos. Así nació todo esto” recordó Martínez.
“Eramos docentes de la Universidad de La Plata y muchos de los que fueron nuestros alumnos fueron después nuestros principales clientes” aseguró Noseda.
Durante la entrevista los líderes de Laboratorio Azul Diagnóstico se refirieron a la historia y la actualidad de la empresa.
Además recordaron al Dr. Juan Carlos Bardón, parte importante del Laboratorio y que por su trayectoria desde hace 3 años el Estudio de nuestra Radio lleva su nombre.
Compartimos el informe del INTA con la palabra de Miguel Taverna, del INTA Rafaela, acerca de la presentación del primer tambo robotizado del país que operará con 40 vacas bajo un sistema pastoril intensificado.
“El tambo lo que pretende es un sistema donde las vacas se van a ordeñar voluntariamente, es un sistema distinto a lo que estamos acostumbrados a ver” expresó Taverna.
Las plantas han de poder reaccionar a las variaciones climáticas, al ritmo diario, a la oferta de agua y nutrientes y a los ataques de insectos. Para ello requieren una red de sustancias reguladoras, las fitohormonas. Gracias a estas sustancias, las plantas pueden responder al estrés biótico y abiótico mediante acciones coordinadas entre sí, así como iniciar procesos específicos de desarrollo. En este artículo se presenta un método de análisis altamente sensible para la determinación cuantitativa de las fitohormonas. Ejemplos fundamentales de las hormonas vegetales son el ácido jasmónico (JA), la citoquina, la auxina, el ácido abscísico, el ácido salicílico, la giberelina y la estrigolactona.
La fitohormona JA tiene, entre otros, un papel esencial como indicadora de heridas en la defensa contra los insectos herbívoros. Los insectos masticadores o chupadores (Fig. 1) inducen en la hoja la activación de la biosíntesis de JA y, con ella, la acumulación de JA. Todos los derivados de JA que se producen fruto de la metilación, glicosilación, hidroxilación o esterificación con aminoácidos se agrupan bajo el término «jasmonatos». Entre ellos, tiene un papel aún más importante el derivado esterificado con el aminoácido isoleucina, la jasmonil-isoleucina (JA-Ile).
La JA-Ile representa la forma biológica activa de la fitohormona (Wasternack y Hause, 2014). Desencadena numerosas respuestas defensivas, como la producción de sustancias locales tóxicas o inhibidoras de la digestión. De este modo, tras ser mordidas por un insecto las plantas pueden sintetizar inhibidores de la proteinasa que en el intestino de los insectos impedirá la digestión de los materiales de las plantas ingeridos (Wasternack y Hause, 2014). También se liberan sustancias volátiles como, p. ej., el jasmonato metílico, que atraen a los depredadores (insectos repelentes y depredadores) de las plagas de las plantas (Kessler y Baldwin, 2001). Por otro lado, las partes no infectadas de una planta afectada, gracias al señal móvil del jasmonato, activan las alarmas y están más preparadas para defenderse contra el ataque (Glauser et al., 2008).
Desde el punto de vista de las plantas, es importante limitar al máximo posible el estado de defensa, ya que este proceso requiere mucha energía y por tanto reduce el crecimiento y la capacidad de adaptación de la planta a otras condiciones de estrés. La regulación de la concentración de JA y de la molécula indicadora JA-Ile biológicamente activa requiere un control estricto de la nueva síntesis, del transporte y de la degradación de estas sustancias. La caracterización de los sustratos y productos de degradación del metabolismo de JA y su cuantificación en tejidos vegetales heridos, estresados o atacados son por tanto el principal objetivo de la presente investigación.
Análisis HPLC-MS/MS
Para el estudio de la respuesta ante lesiones se necesita una analítica especialmente sensible, ya que las fitohormonas en los tejidos vegetales están presentes en concentraciones muy bajas (< 10 nmol/g de peso en fresco).
Asimismo, la matriz vegetal constituye una mezcla de gran complejidad, lo que dificulta la detección y la cuantificación de los analitos menos abundantes. Para estas exigentes tareas de análisis es adecuada la cromatografía de líquidos de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS). Con la cromatografía se separan temporalmente los compuestos químicos del extracto de la hoja según su estructura química con una columna cromatográfica.
En la cromatografía en fase reversa utilizada aquí, las sustancias se combinan por efectos de interacción hidrófoba en la fase estacionaria y se eluyen de la columna con la ayuda de un disolvente orgánico de gradiente creciente. A continuación, se realiza la detección de los compuestos eluidos mediante espectrometría de masas.
Para la identificación de un compuesto químico se utiliza por un lado un tiempo de retención específico en el que se eluye una sustancia de la columna cromatográfica y, por el otro, su masa/relación de carga por peso total, registrada por el espectrómetro de masas (valor m/z).
En el espectrómetro de masas en tándem utilizado, ajustado en modo «Multiple Reaction Monitoring» (MRM), se utiliza el valor m/z de la molécula deprotronada intacta ([M-H]-) en combinación con el valor m/z de un fragmento específico de este ion para la identificación unívoca del compuesto químico.
En las aplicaciones HPLC-MS, es esencial utilizar un eluyente de alta pureza (grado LC-MS) o agua ultrapura, ya que la sensibilidad y la fiabilidad del método dependen en gran medida de la pureza del eluyente.
Cuantificación de jasmonatos y precursores
El material de muestra congelado por choque térmico se extraerá con un sistema de extracción bifásico a partir de una mezcla de terc-butil metil éter, metanol y agua (Matyash et al., 2008). Para la cuantificación se añadirán patrones de fitohormonas adecuadamente deuterizados en las cantidades definidas. La fase orgánica se utilizará para el análisis después de la extracción.
El análisis se realizará en un sistema HPLC/nanoESI-MS/MS compuesto por un sistema HPLC Agilent 1100 (Agilent, Waldbronn, Alemania) acoplado a un espectrómetro de masas de trampa iónica de triple cuadrupolar/lineal híbrido Applied Biosystems 3200 (MDS Sciex, Ontario, Canadá) (Iven et al., 2012). La ionización por nanoelectrospray (nanoESI) se asegurará con una fuente de iones basada en chip (TriVersa NanoMate; Advion BioSciences, Ithaca, NY, EE. UU.) (Fig. 2).
Fig. 2: Sistema HPLC/nanoESI-MS/MS para el análisis de jasmonatos. Como espectrómetro de masas se utiliza el equipo de trampa iónica de triple cuadrupolar/lineal híbrido 3200 de la marca Applied Biosystems. La ionización por nanoelectrospray (nanoESI) se asegura con la fuente de iones basada en chip TriVersa NanoMate (Advion BioSciences). El sistema HPLC de Agilent no se muestra. (Foto:Departamento de Bioquímica de las Plantas, Albrecht-von-Haller-Institut, Universidad Georg-August, Gotinga).
La separación HPLC se realiza con una columna C18 («EC 50/2 Nucleodure C18 gravity 1,8 μm“; 50 x 2,1 mm, tamaño de partícula 1,8 μm; Macherey und Nagel, Düren, Alemania) y utilizando un gradiente de disolvente binario de acetonitrilo (Fisher Scientific, Leics, Reino Unido) y agua ultrapura del sistema Arium pro VF TOC (Sartorius, Gotinga, Alemania) en cada caso reducido al 0,1% con ácido acético.
Las especies de fitohormonas se detectan en modo negativo de ionización por electrospray mediante «Multiple Reaction Monitoring». Para la cuantificación se crearán curvas de calibración en base a los niveles de intensidad de los valores m/z de las sustancias no marcadas con relación a las sustancias marcadas con deuterio correspondientes frente a las cantidades molares de las sustancias no marcadas.
Producción de agua ultrapura
Fig. 3: Sistema de agua ultrapura de Sartorius arium pro VF TOC (Foto: Sartorius).
El sistema arium pro VF TOC (Sartorius, Gotinga, Alemania, Fig. 3) se ha utilizado para producir agua ultrapura para los análisis de HPLC/nanoESI-MS/MS. Elimina del agua potable pretratada las impurezas aún presentes. La producción de agua ultrapura requiere una recirculación continuada del agua dentro del sistema y un caudal de agua constante, lo que se consigue mediante un sistema de bombeo con regulación de la presión. La conductividad del agua se mide tanto en la entrada del agua de alimentación como en el agua de producto en la salida de agua. El contenido de TOC (total organic carbon = carbono orgánico total) se supervisa mediante un monitor TOC especial.
El sistema arium pro VF TOC utilizado en las investigaciones aquí descritas funciona con dos cartuchos diferentes. Estos cartuchos están llenos de un absorbedor especial de carbón activo y de resinas de intercambio de iones en lecho mezclado que pueden suministrar agua ultrapura con un contenido de TOC de hasta < 2 ppb. Asimismo se ha integrado una lámpara de UV, que a unas longitudes de onda de 185 nm y 254 nm actúa como oxidante y elimina los gérmenes.
El sistema arium pro VF TOC incorpora además un módulo de ultrafiltración que se emplea como filtro de flujo cruzado. La membrana de ultrafiltración utilizada retiene coloides, microorganismos, endotoxinas, ARN y ADN.
En la salida de agua se ha instalado un filtro final de 0,2 μm que sirve para la eliminación de partículas y bacterias durante la dosificación del agua ultrapura elaborada. El proceso de purificación de agua específico del aparato está representado en la figura 4.
Fig. 4: Representación esquemática del diagrama de flujo en el sistema de agua ultrapura arium pro VF TOC. Para ofrecer una visión más clara no se han incluido las válvulas y su control.
Para los análisis de HPLC/nanoESI-MS/MS se ha utilizado agua ultrapura con un contenido de TOC < 5 ppb y una conductividad de 18,2 MΩ x cm (compensada a 25 °C).
Resultados
La respuesta a las heridas de las plantas se estudia intensivamente en muchas especies vegetales como, p. ej., el tomate (Lycopersicum esculentum), el tabaco (Nicotiana tabacum) y el berro del thale (Arabidopsis thaliana). Para nuestros análisis utilizamos la planta modelo Arabidopsis thaliana. Se practicaron heridas en las rosetas del berro del thale con unas pinzas dentadas sobre la nervadura central de la hoja (Fig. 1B) y se recogieron a los 30 min y 120 min.
Fig. 5: Biosíntesis de la fitohormona ácido jasmónico (JA) y del derivado activo jasmonil-isoleucina (JA-Ile) mediante los precursores ácido alfa-linolénico, ácido 12-oxo-fitodienoico (OPDA) y ácido 3-oxo-2(2-pentenil)-ciclopentano-1-tetraenoico (OPC-4).
Como control se utilizaron rosetas de plantas sin lesiones. Se incluyeron en el análisis, además del JA y el derivado biológicamente activo JA-Ile, sus precursores de biosíntesis ácido 12-oxo-fitodienoico (OPDA) y ácido 3-oxo-2(2-pentenil)-ciclopentano-1-tetraenoico (OPC-4) (Fig. 5).
Para registrar cuantitativamente las cantidades de estos metabolitos en los tejidos de las plantas por medio de análisis HPLC/nanoESIMS/ MS es necesario añadir una cantidad definida de sustancias deuterizadas idénticas o de estructura química muy parecida (D5-OPDA, D6-JA, D3-JA-Ile) para la extracción y utilizarlas posteriormente como patrones internos. Para ello se añadieron las sustancias patrón antes de la extracción en cantidades de 30 ng (D5-OPDA) y 10 ng (D6-JA y D3-JA-Ile) a 200 mg de material de las plantas.
Las señales detectadas mediante análisis HPLC/nanoESI-MS/MS de los analitos (OPDA, OPC-4, JA, JA-Ile) y de las sustancias patrón deuterizadas correspondientes se muestran en la Figura 6 como cromatograma de iones extraídos (CIE). En las plantas de control sin lesiones, OPC-4, JA y JA-Ile no eran detectables.
Solo se pudieron detectar los patrones deuterizados correspondientes y pequeñas cantidades de OPDA (Fig. 6A). En cambio, en las plantas heridas (2 h tras la lesión) se observaron claras señales de los jasmonatos endógenos (JA y JAIle) así como señales menos intensas de los precursores OPC-4 y OPDA (Fig. 6B).
El análisis HPLC/nanoESI-MS/MS permite, mediante el uso del patrón deuterizado correspondiente, una cuantificación exacta de los jasmonatos y sus precursores en los extractos de hoja.
Fig. 6: Cromatograma de iones extraídos (EIC) del análisis HPLC/nanoESI-MS/MS para OPDA, OPC-4, JA y JA-Ile y las correspondientes sustancias patrón deuterizadas (D5-OPDA, D6-JA, D3-JAIle). A) CIE de las plantas de control sin lesiones.B) CIE de las plantas heridas (2h tras la lesión).
Debido a la respuesta a la lesión apreciada y continuada en las plantas al cabo de pocos minutos (Glauser et al., 2008), en las rosetas del berro del thale los precursores de JA (OPDA y OPC-4), JA y JA-Ile están presentes en grandes concentraciones al cabo de solo 30 min. de la lesión (Fig. 7).
La concentración de JA en este experimento fue de 2,2 nmol/g de peso en fresco. JAIle estuvo presente en concentraciones de 0,8 nmol/g de peso en fresco. La concentración de estos dos jasmonatos aumenta además ligeramente durante los siguientes 90 min, llegando hasta 2,5 o 1,2 nmol/g de peso en fresco.
Fig. 7: Análisis cuantitativo del ácido jasmónico (JA) y del derivado de aminoácido jasmonil-isoleucina (JA-Ile) así como los precursores OPDA y OPC-4 en extractos de hoja de plantas heridas y las correspondientes plantas de control de Arabidopsis thaliana. Las rosetas de las plantas analizadas se recogieron sin heridas antes del inicio del ensayo y a los 30 min y a las 2 h de practicarse las lesiones, y se congelaron por choque térmico en nitrógeno líquido. Tras la extracción se cuantificaron los analitos mediante análisis HPLC/nanoESI-MS/MS.[f.w.= fresh weight]
En este lapso temporal aumentan simultáneamente las concentraciones de los precursores OPDA y OPC-4 (Fig. 7). Con el análisis HPLC/nanoESI-MS/MS aquí presentado y utilizando agua ultrapura del sistema arium pro VF TOC, el límite de detección de los jasmonatos y sus precursores en el tejido de las hojas de Arabidopsis thaliana es de 1 pmol/g de peso en fresco en el caso de OPDA y JA-Ile y de 15 pmol/g de peso en fresco para OPC-4 y JA.
Discusión
El método aquí descrito de espectrometría de masas en tándem acoplada a HPLC permite el análisis cuantitativo de las hormonas vegetales en la gama de concentraciones picomolares. La alta sensibilidad y la especificidad del método que son necesarias para ello imponen unos claros requisitos en la calidad del solvente utilizado.
Durante la separación cromatográfica, el gradiente utilizado del solvente es responsable de la progresiva elución de los analitos de la columna. En la fuente del espectrómetro de masas, los solventes se evaporan posteriormente con un flujo de gas y se transfieren los analitos como iones libres en la fase gaseosa.
Con una ionización positiva, idealmente los analitos serán protonados ([M+H]+), mientras que en la ionización negativa serán deprotonados ([M-H]-). Sin embargo, en la ionización por electrospray al registrar iones extraños (p. ej., Na+, NH4 +, Cl-, CH3COO-) pueden producirse también iones cuasimoleculares, que se conducirán por medio del campo de tensión al espectrómetro de masas y producirán señales en el detector.
En consecuencia, puede ser un problema si el solvente contiene iones en forma de impurezas, ya que ocasionarán numerosos aductos posibles en los analitos. Los cationes de sodio desempeñan un papel especialmente significativo en la formación de aductos. En comparación con [M+H]+ o [M-H]- , forman entre otras aducciones de [M+Na]+ o [M+Na+ácido acético-2H]-.
Cuando se produce una intensa formación de aductos, la cantidad de iones protonados o deprotonados (que generalmente se utilizan para el análisis) se reduce proporcionalmente. Por tanto, la formación de aductos puede reducir considerablemente la sensibilidad de un método e influir negativamente en los límites de detección de analitos.
Durante el almacenamiento prolongado de agua de alta pureza (p. ej., grado LC-MS) en botellas de vidrio pueden lixiviarse cationes de sodio del vidrio, lo que ocasionará una mayor formación de aductos durante el análisis. Este problema se puede evitar utilizando el sistema arium pro VF TOC, ya que permite disponer en todo momento de agua ultrapura recién preparada para los análisis HPLC/nanoESI-MS/MS.
En estudios previos se estableció asimismo que el agua ultrapura de arium, con un promedio de 3,82 ppb de TOC, tiene un contenido claramente inferior de TOC que el agua (grado LC-MS) de botellas recién abiertas de los proveedores habituales del mercado, que tienen un promedio de 45,5 ppb de TOC (medido el 23/4/2013).
Esta hipótesis es ratificada por los análisis realizados por Tarun et al. (2014), que muestran valores superiores de impurezas orgánicas en el agua embotellada para análisis HPLC disponible en el mercado en comparación con el agua ultrapura recién preparada.
Bibliografía:
1. Wasternack C. y Hause B.: Jasmonsäure – ein universelles Pflanzenhormon, Biol. Unserer Zeit, 3/(2014) (44)
2. Kessler A. y Baldwin I.T.: Defensive Function of Herbivore-Induced Plant Volatile Emissions in Nature. Science 291, 2141 (2001)
3. Glauser G., Grata E., Dubugnon L., Rudaz S., Farmer E. E. y Wolfender J.-J.: Spatial and Temporal Dynamics of Jasmonate Synthesis and Accumulation in Arabidopsis in Response to Wounding, Journal of Biological Chemistry Volume 283, núm. 24, 13 de junio (2008)
4. Matyash V., Liebisch G., Kurzchalia T.V., Shevchenko A., Schwudke D.: Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J. Lipid Res. 49: 1137-1146 (2008)
5. Iven T., König S., Singh S., Braus-Stromeyer S.A., Bischoff M., Tietze L.F., Braus G.H., Lipka V., Feussner I., Dröge-Laser W.: Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Mol Plant. 5(6):1389-1402 (2012) Información en los datos complementarios de este artículo
6. Tarun M., Monferran C. Devaux C. y Mabic S.:“Vor Gebrauch beachten – Wie wichtig ist Reinstwasser für die HPLC ?“, LaborPraxis LP 7/8, año 38, Agosto de 2014
Agradecimientos:
Los autores desean agradecer especialmente a los Prof. Dr. Ivo Feußner, Sabine Freitag, Pia Meyer y Hanno Resemann (Departamento de Bioquímica de las Plantas, Albrecht-von-Haller-Institut, Universidad Georg-August, Gotinga) por el apoyo prestado.
Autores:
Dr. Tim Iven, Departamento de Bioquímica de las Plantas, Albrecht-von-Haller-Institut, Universidad Georg-August, Gotinga
Dr. Kirstin Feußner, Departamento de Bioquímica de las Plantas, Albrecht-von-Haller-Institut, Universidad Georg-August, Gotinga
Dr. Cornelia Herrfurth, Departamento de Bioquímica de las Plantas, Albrecht-von- Haller-Institut, Universidad Georg-August, Gotinga
Dr. Elmar Herbig, Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG, Gotinga
El Programa AGROVALOR convocó oportunamente a las universidades Nacionales para la creación de Unidades Productivas de Innovación Agropecuaria y Agregado de Valor (UPIAAV). Se trata de complejos productivos innovadores con alta potencialidad de trasferencia de conocimientos, innovación y vinculación tecnológica al sector productivo, en particular a pequeños y medianos productores. Se presentaron más de 80 proyectos a nivel nacional entre los cuales resultaron financiados dos correspondientes a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA.
![Fig. 7: Análisis cuantitativo del ácido jasmónico (JA) y del derivado de aminoácido jasmonil-isoleucina (JA-Ile) así como los precursores OPDA y OPC-4 en extractos de hoja de plantas heridas y las correspondientes plantas de control de Arabidopsis thaliana. Las rosetas de las plantas analizadas se recogieron sin heridas antes del inicio del ensayo y a los 30 min y a las 2 h de practicarse las lesiones, y se congelaron por choque térmico en nitrógeno líquido. Tras la extracción se cuantificaron los analitos mediante análisis HPLC/nanoESI-MS/MS.[f.w.= fresh weight]](http://www.motivar.com.ar/wp-content/uploads/2015/06/Sartorius7.jpg)
